在酸性溴化鹽溶液中，3-氯丙醇酯轉化為3-氯丙二醇（3-MCPD）單酯、2-氯丙醇酯轉化為2-氯丙二醇（2-MCPD）單酯、縮水甘油酯轉化為3-溴丙二醇（3-MBPD）單酯。隨后，在酸性甲醇溶液中3-MCPD酯、2-MCPD酯和3-MBPD酯轉化為氯丙醇和溴丙醇，酸水解得到的溶液經(jīng)碳酸氫鈉溶液中和后，通過硅藻土小柱進行凈化，使用七氟丁酰基咪唑對3-MCPD、2-MCPD及3-MBPD進行衍生，氣相色譜-質譜檢測，內(nèi)標法定量。

實驗用到的標準品信息見下表：

表1 標準品信息

2.1 標準品溶液配置

氯丙醇酯、縮水甘油酯混合標準中間液（10 μg/mL）：分別準確移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE、GE標準溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20℃保存，保存期6個月。

氯丙醇酯、縮水甘油酯混合標準工作液CaL I（2 μg/mL）：準確移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯縮水甘油酯混合標準中間液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3個月。

氯丙醇酯、縮水甘油酯混合標準工作液CaL II（0.2 μg/mL）：準確移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯縮水甘油酯混合標準中間液I，用甲苯定容至10 mL。臨用現(xiàn)配。

內(nèi)標混合標準工作溶液（D5-3-MCPDE:2µg/mL，D5-2-MCPDE:2µg/mL，D5-GE：2µg/mL）：分別準確移取0.4 mL 50 μg/mL D5-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE標準溶液到10 mL容量瓶中，用甲苯稀釋至刻度。于-20 ℃保存，保存期 3個月。

2.2 標準曲線配制

配制氯丙醇酯和縮水甘油酯標準曲線，取 5 支 8 mL玻璃螺紋樣品瓶中，分別加入 2 mL 四氫呋喃，再準確加入 100 μL 混合內(nèi)標工作液（2.00 µg/mL），渦旋混勻后，按照下表加入混合標準工作溶液，按照“樣品前處理"進行后續(xù)操作，上機檢測得到標準曲線。

表2 氯丙醇酯、縮水甘油酯標準曲線的配制

標準品配制注意事項：

1、氯丙醇酯濃度均以對應的氯丙醇計，縮水甘油酯濃度以縮水甘油計，定量計算中需特別注意。

2、如使用純品型標品，需注意計算標品的純度和對應的折算系數(shù)。建議選擇安譜璀世溶液型標品，進行稀釋配制，操作更加方便。

試劑配置：

0.7%酸性溴化鈉溶液：稱取1.0 g溴化鈉，加入10 mL水溶解，混勻；從中取出1.0 mL，加入1.0 mL硫酸和12 mL水，混勻，有效期1個月。

碳酸氫鈉溶液（0.6%）：稱取0.6 g碳酸氫鈉。加入80 mL純水，溶解后轉移至100 mL容量瓶中，純水定容至100 mL，臨用現(xiàn)配。

飽和碳酸氫鈉溶液（9.6%）：稱取9.6 g碳酸氫鈉。加入100 mL純水，加熱溶解后，降至室溫，溶液中存在沉淀，臨用現(xiàn)配。

硫酸-甲醇（1.8%）：吸取1.8 mL硫酸于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，建議臨用現(xiàn)配。

乙_醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙_醚和石油醚各100 mL，混勻。

試樣提取：

準確稱取嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g（精確至1 mg）于40 mL玻璃螺紋樣品瓶中，準確加入100 µL混合內(nèi)標工作液（2 µg/mL）；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水，渦旋混勻，再加入1 mL氨水，蓋塞渦旋混勻，在65℃±5℃水浴下振蕩30 min，取出后冷卻至室溫。加入3 mL乙醇，渦旋后加入5 mL乙_醚，振搖5 min，然后加入5 mL石油醚，繼續(xù)振搖5 min。待溶液靜置分層后，取上層溶液于40 mL玻璃樣品瓶中；再加入乙_醚和石油醚各5 mL，重復萃取1次，合并有機相于40℃下氮吹濃縮至1mL左右，待凈化。

脂肪的凈化：

將上述待凈化溶液轉移至活化后的氨基固相萃取柱【SBEQ-CA2154，500 mg/6 mL 小柱臨用前用6mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)溶液活化】中，加入12mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)溶液洗脫，收集全部流出液及洗脫液，于40 ℃下氮吹至干，供溴代反應。

溴代反應和酸水解：

向提取樣品中加入2 mL四氫呋喃，渦旋混勻后，再加入30 μL 0.70%酸化溴化鈉溶液，混勻后，于50℃下放置15 min進行溴代反應。結束后加入3 mL 0.60%碳酸氫鈉溶液中和，渦旋30 s。加入3 mL正己烷萃取，充分渦旋，靜置待溶液分層后，取上層溶液在40℃下氮吹至干，加入1 mL四氫呋喃復溶。

于上述復溶溶液中加入1.8 mL 1.8%硫酸-甲醇溶液，渦旋混勻，于40℃下水解約16 h，結束后加入0.50 mL 9.6%碳酸氫鈉溶液中和，渦旋，將溶液在40 ℃下氮吹至體積為1 mL~1.5 mL；溶液供凈化。

試樣凈化：

將上述中和后的水解液全部轉移至硅藻土小柱（SBEQ-CA3918-MCPD，5 g/60 mL）上，放置10 min，然后用25 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，再用35 mL二氯甲烷洗脫。

收集洗脫液，加入10 g脫水劑（無水硫酸鈉和無水硫酸鎂各5 g），溶液放置至少30 min，期間不時振搖4次~5次，以徹_底脫水；將溶液轉移至40 mL玻璃螺紋樣品瓶中，于40℃水浴氮吹濃縮至約0.5 mL，將濃縮液轉移至20 mL頂空瓶中，用2 mL正己烷分兩次淋洗螺紋瓶內(nèi)壁，洗液一并轉入頂空瓶中，待衍生。

衍生化反應：

于凈化后濃縮液中，用氣密針快速加入0.05 mL七氟丁酰基咪唑，立即壓蓋，渦旋30 s后，于70 ℃保溫20 min。衍生結束后取出頂空瓶，冷卻至室溫，加入2 mL 20%氯化鈉溶液，充分渦旋使上層溶液澄清，靜置使水相和正己烷分層，取上層溶液至裝有約0.3 g無水硫酸鈉的玻璃樣品瓶中，渦旋混勻10 s，提取液過0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯(lián)質譜儀進行測定。

前處理注意事項：

1、前處理過程中盡量避免使用塑料耗材，可使用玻璃小柱、玻璃螺紋瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動進樣針等耗材，建議進行方法空白實驗監(jiān)控過程本底情況；

2、七氟丁酰基咪唑易吸水，建議低溫干燥保存（可放于含有干燥劑的袋子中然后置于冰箱保存），建議臨用前從冰箱拿出；

3、衍生反應需在密閉性良好的帶蓋玻璃管中進行，建議使用頂空瓶進行；

4、建議使用疏水性PTFE針式濾器進行過濾。

儀器維護注意事項：

1、隨著進樣次數(shù)的增加，儀器輕微污染，目標物保留時間可能發(fā)生偏移；

2、該實驗對儀器污染比較嚴重，儀器受到嚴重污染后，可能導致目標物響應降低、分離度變差等情況，需注意儀器的清洗維護，包括進樣針的清洗，離子源的清洗，色譜柱的老化等；

3、如儀器配制程序升溫進樣口和反沖功能，可明顯降低對儀器的污染程度。

4、建議色譜柱加裝2m 相同固定相的預柱，定期對預柱進行更換，可延長色譜柱的使用壽命。

6.1 標準曲線數(shù)據(jù)

以標準品與內(nèi)標的質量為橫坐標，目標物與其對應內(nèi)標的峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。3-MCPDE、2-MCPDE、GE的標準曲線和相關系數(shù)見下表：

表4  3-MCPDE、2-MCPDE、GE的標準曲線

6.2 加標回收率數(shù)據(jù)

本次實驗方法空白未檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯，奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量分別為0.028、0.013、0.007 mg/kg。

奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的加標回收率數(shù)據(jù)見下表。

表5  奶粉基質的加標回收率數(shù)據(jù)（n=3）

數(shù)據(jù)計算注意事項：

1、本實驗3-氯丙醇酯使用D5-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量內(nèi)標；2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量內(nèi)標；縮水甘油酯使用D5-縮水甘油棕櫚酸酯作為定量內(nèi)標；酸水解方法中3 -氯- 1, 2-丙二醇酯不會轉換成縮水甘油（Gly），因此不影響縮水甘油酯含量的計算。

使用安譜實驗標準品和相關耗材，參照國標《GB 5009.191-2024 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定》第二篇第二法，對酸水解方法，使用同位素內(nèi)標法進行定量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在90%-110%之間，RSD小于13%。該方法操作簡便，最然時間較長，但縮水甘油酯含量不受氯丙醇轉換影響，方便理解。安譜實驗標準品和相關耗材能夠很好的滿足奶粉基質中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測。